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SNP基因分型服务

发布时间:2014年01月27日发布人:百力格生物技术关注度:4095

1 .SNP分型的基本原理

2. SNP分型的常用方法

3 .百力格SNP分型服务要求 

 
1 .SNP分型的基本原理
 
一、SNP分型定义
        单核苷酸多态性(SNP)是指有单个核苷酸替代、插入或缺失而形成的分子形态。SNP是人类基因组中数量最多的一种多态形式,人类基因组中总共有300万个SNP,平均每1000个碱基中就有一个SNP,继微卫星之后的第三代遗传标记。 
 
二、SNP分型的应用 
        1、用于解释个体间的表型差异,不同群体及个体对疾病,尤其是对复杂性状疾病的易感性,对各种药物的耐受性; 
        2、用于定位疾病相关基因、分析疾病的关联性、阐明疾病发生的分子遗传机制以及药物基因组学中的用药指导和药物设计等。 
        SNP,即单核苷酸多态性(SingleNucleotide Polymorphism,SNP),主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。与其它分子标记相比,SNP分辨率最高也最为丰富,覆盖基因组范围大,遗传上比较稳定。在人类基因组中,估计平均每1,000个碱基对就有1个SNP,估计其总数可达300万个甚至更多,是继微卫星之后的第三代遗传标记。 
        SNP分布不均匀,在非转录序列中要多于转录序列,绝大多数位于蛋白的非编码区。通常情况下是一种二等位基因的变异,多为转换,即一种嘧啶碱基换为另一种嘧啶碱基,或一种嘌呤碱基换为另一种嘌呤碱基,转换与颠换之比为2:1。SNP在CG序列上出现最为频繁,而且多是C→T,因为CG中C即胞嘧啶常被甲基化,自发脱氨后即变为胸腺嘧啶。
 
1、SNP主要应用领域 
 
1. 遗传图谱绘制的标记; 
2. 疾病诊断和疾病易感基因的鉴别; 
3. 药物基因组学研究和新药筛选; 
4. 药物代谢和药物遗传学;
5. 法医鉴定和个体识别; 
6. 群体遗传学研究和遗传多态性分析; 
7. 物种鉴定、菌种鉴定等。 
 
 
2.SNP分型的常用方法
 
        有直接测序法、MassArray质谱法、多重SNaPshot法、连接酶检测反应(LDR)分型方法、TaqMan探针分型法、酶切法、荧光PCR法、DNA芯片法等。 
 
        1. 直接测序法
        对欲检测片段进行直接PCR扩增、采用ABI 3730xl DNA测序仪测序,是SNP检测的金标准。,纯合型SNP位点的测序峰为单一峰型,而杂合型SNP位点的测序峰为套峰,因而很容易将其区分开来。 
        特点:信息量大,能发现未知SNP位点。
 
 
        2. MassArray 质谱法 
        MassArray简介
        Sequenom MassArray飞行时间质谱生物芯片系统是为基因组学研究提供兼顾灵敏度和特异性服务的中高通量技术平台,广泛地应用于遗传突变检测、SNP分型以及DNA甲基化定量分析研究,是目前唯一采用质谱法进行直接检测的设备。Sequenom MassArray系统反应体系为非杂交依赖性,不需要各种标记物,实验设计灵活,更可实现高达40重反应,是目前市场上拥有最高性价比的检测系统。 
 
        技术特点
        1.高通量: 一张芯片可对384个样本进行多重检测;每个体系最多可实现40重反应,通量可根据客户要求进行个性化调整。
        2.高性价比:无需荧光标记,仅需合成普通引物,大大降低成本;
        3.高灵敏度: 分析所需样本量少(10ng),准确性>95%;检出率>90%。
        4.高灵活度: 一张芯片上样本数量和位置可随意选择、样本和位点检测匹配可随意选择。
 
        检测原理
        Sequenom MassArray系统主要是利用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱 (MALDI-TOF MS) 进行分析,即PCR扩增产物或者预处理样本在延伸单碱基后,将制备的样品分析物与芯片基质共结晶,将该晶体放入质谱仪的真空管,而后用瞬时纳秒 (10-9s)强激光激发,由于基质分子经辐射所吸收的能量,导致能量蓄积并迅速产热,从而使基质晶体升华,核酸分子就会解吸附并转变为亚稳态离子,产生的离子多为单电荷离子,这些单电荷离子在加速电场中获得相同的动能,进而在一非电场漂移区内按照其质荷比率得以分离,在真空小管中飞行到达检测器。 
 
        检测服务流程 
        1.客户提供样本及检测位点信息→2.样本完整性检测以及前处理→3.引物设计、合成→4.预试验 →5.PCR扩增、SAP纯化、延伸→6.点样→7.质谱分析→8.分析报告。 
        实验流程示意图 
 
        3 多重SNaPshot法 
        多重SNaPshot SNP分型是一种以多重引物延伸为基础、可同时对多个已知SNP 位点进行遗传分型的自动化方法。该技术由美国应用生物公司(ABI)开发,主要针对中等通量的SNP分型项目。
 
        基本原理 
        在一个含有测序酶,四种荧光标记的ddNTP,紧挨多态位点5’ 端的不同长度延伸引物和PCR产物模板的反应体系中,引物延伸一个碱基即终止,经ABI测序仪跑胶后,根据峰的颜色可知掺入的碱基种类,从而确定该样本的基因型,根据峰移动的胶位置确定该延伸产物对应的SNP位点。对于PCR产物模板可通过多重PCR反应体系来获得。 
 
        技术原理图 
        
        方法特点
        ◆分型准确,其准确度达99.9%;
        ◆可多位点同时检测; 
        ◆不受SNP位点多态特性限制;
        ◆不受样品个数的限制; 
 
        适宜范围
        适宜100-4000 个样品;8-40 位点;  
 
        实例 
        A) 9个SNP位点的分型图 
         
 
        B) 单个位点分析图 
        样本1, 基因型G/G;样本2, 基因型A/A;样本3, 基因型A/G
         
 
        4 连接酶检测反应(LDR)分型方法  
        理论依据  
        主要应用连接酶检测反应 (ligase detection reaction,LDR)技术。即在Taq DNA连接酶的作用下,当SNP位点上下游两条寡核苷酸探针与目的DNA序列完全互补,并且两条探针之间没有空隙时才能发生连接反应,否则连接反应不能进行,最后通过荧光扫描片段长度,实现对SNP 位点的检测。 
  
        核心技术 
        ◆多重PCR;  
        ◆多重LDR; 
        ◆ABI3730XL 检测。 
  
        原理示意图 
          
 
 
         方法特点
         1.适用于任何多态性位点,不需要人工引入酶切位点; 
         2.分型准确,其准确度可达99%以上; 
         3.检出率高,周期短。 
 
         适宜范围:  
         适宜 100-3000个样品,1-20个位点 
 
         5 TaqMan探针分型技术平台 
 
         7900HT system complete with Automation Accessory and Windows XP® computer 
         1.该技术是由ABI研发的SNP分型技术,其技术原理如下:PCR反应时,加入一对两端有不同荧光标记的MGB特异探针来识别不同等位基因(allele1和allele2),5’ 端为报告荧光基团(reporter),3’ 端为淬灭荧光基团(quencher)。PCR过程中,两个探针能与正向引物和反向引物之间的互补序列特异退火结合。当探针以完整形式存在时,由于能量共振转移,荧光基团只发出微弱荧光。特异的探针与相应的等位基因结合后,DNA聚合酶发挥5’ 到3’ 外切酶活性,把报告荧光基团切割下来,脱离3’ 端淬灭荧光基团的淬灭作用(quench),从而发出荧光。两个探针的5’ 端标有不同的荧光(FAM或VIC),3’ 端标有MGB淬灭基团结合体。根据检测到的不同荧光,可以判断相应样本的SNP等位基因型。(具体见下图) 
 
 
        2.TaqMan®MGB探针特点:  
        (1)探针较短(~13bp);  
        (2)较短探针提高鉴定的准确性;  
        (3)小沟结合物增加了较短探针的熔点温度(Tm);  
        (4)TaqMan® MGB探针对富含A/T的序列有良好的鉴定能力。3.该技术操作简单快速,软件分析结果清晰,标出了每个样本的基因型及荧光强度,非常直观,特别适合少量位点大量样本(上千个)的分型项目。右图为软件分析案例。 
 
 
 
3 .百力格SNP分型服务要求  
 
        1. 样品
        (1)DNA样品:待检测DNA样品浓度要相对均一,DNA样品浓度在10~50 ng/µl之间,体积>20 μl,用双蒸水或者TE缓冲液溶解,不含PCR抑制剂。务必注明样品的准确浓度。
为了保证样品质量能够达到SNP检测要求,正式实验前我们需要对样品DNA浓度与质量进行检测,并根据检测结果进行浓度调整;随机选取10个样品,用我们公司已有的高频率SNP位点所对应的引物进行SNP分型实验,我们会将DNA鉴定结果及时告知客户并共同决定是否进入正式实验。
        (2)血液或组织样本:血液样本用EDTA抗凝剂的真空管采集或枸椽酸钠抗凝,采集后放入-20℃保存(最好-80℃保存),体积大于 1ml;组织样本最好是新鲜(-80℃ 保存)或石蜡包埋的组织,也可以是95%乙醇中固定的组织,组织量大于10 mg。DNA抽提:血液20元/样本;新鲜组织30元/样本;石蜡包埋组织50元/样本。  
 
        2. 客户提供资料
        NCBI基因登录号和rs号或详细的SNP检测位点及上下游各200个碱基的基因组DNA模板序列,并注明在此范围之内所有其它SNP位点。最好能提供待检测SNP位点在采样人群中的等位基因频率信息。 
 
        3 提供结果 
        1. SNPs统计结果(Execl表格);
        2. 实验过程及其涉及的电泳图、酶切图、测序峰型图;
        3. 扩增和反应体系所设计的引物序列;
        4. 客户所需的其他资料。
 

 

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