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全基因合成服务

发布时间:2014年01月27日发布人:百力格生物技术关注度:4015

1.全基因合成简介

2. 全基因合成常见问题

3. 定点突变

4 .百力格全基因合成服务特色

 

1. 全基因合成简介

        在我们的实验工作中,如果采用一般实验手段无法得到目的基因时,可以进行实验室人工合成。

全基因合成操作程序

        1. 我们将对您需要合成的基因全序列进行分析,检查基因内部是否含有重复序列。根据序列的具体情况设 计合成方案并通过业务员或技术员给您报价。

        2. 在得到您认可后我们将立即进行单链 Oligo DNA 合成、 DNA 片段拼接等工作,然后把全长基因克隆于载体 中,再通过 DNA 测序确认合成基因的正确性。

        3. 测序结果如果发现有错误位点,我们会采取相应的技术手段进行修复校对,保证整个序列的正确性。

        4. 提供实验结果:包括实验操作规程、测序结果、测序彩色峰图、含有合成基因的质粒及含该质粒的菌体( 穿刺菌 )等。免费提供密码子优化!!

基因合成应用

         设计合成DNA疫苗

         合成组织样本不易获得但序列已知的基因

         设计基因治疗载体

         合成经过密码子优化,提高外源表达的基因

         用于微芯片的大量cDNA

         根据基因结构功能研究的需要对基因进行修正

         克隆人鼠抗体或重组抗体

         合成序列保真度要求高,无突变或SNP存在的基因

 

2 .全基因合成常见问题

Q1.化学合成基因的方法有哪些?

        (1)全基因合成:一般对于分子较小而又不易得到的基因采用该方式。可将双链基因分成若干寡核苷酸单链片段(尤其待合成基因在100个核苷酸以上时),每个片段长度控制在40~60个碱基,并使每对相邻互补的片段之间有大于6bp交叉重叠。在体外将所有对应的片段混合经PCR反应即可拼接得到较长的基因片段。采用分步连接、亚克隆的方法时,最后将亚克隆的较大片段重组为完整的基因。为便于亚克隆中回收基因片段,应在片段两侧设计合适的酶切位点;由于每个亚克隆可以分别鉴定,从而可减少顺序错误的可能性。

        (2)酶促合成:此法又称基因的半合成法。全基因合成,特别是较大的基因的全部化学合成成本昂贵,使用半合成的方法可以降低成本,从而利于普及使用。首先合成末端之间有10~14个互补碱基的寡核苷酸片段,退火后以重叠区作为引物,在4种dNTP存在的条件下,通过DNA聚合酶或反转录酶的作用,获得两条完整的互补双链。合成基因的结构应包括有克隆和表达所需要的全部信号及DNA顺序,基因密码子的阅读框架也应该同表达体系相适应。此外,由于不同物种的密码子使用偏好性,在基因合成和克隆时必须考虑这个问题。可通过密码子优化获得高效表达。

Q 2. 为什么要进行全基因合成?

        最常见的获得目的基因的方法是PCR 扩增钓取基因。但很多的时候,扩增只会得到痕量或根本就得不到目的基因。如果用这种方法,首先,必须准备某一特定组织的cDNA文库,就必须花时间去准备或订购。其次,目的基因在文库中的含量必须充足,否则就可能会找不到合适的方法钓取或克隆得到。第三,PCR扩增得到的目的基因可能会含有许多点突变或单核苷酸多态性,这会给您后期的实验应用带来极大麻烦。

Q 3. 全基因合成一般服务流程是怎样的?

        (1) 客户提供所需要合成的基因序列信息,可从百力格公司网站(www.bioligo.cn)下载全基因合成订单,务必详细填写;

        (2) 本公司首先将对客户提供的基因全序列进行软件分析,检查基因内部是否含有重复序列及特殊结构,根据序列具体情况设计基因合成方案,并及时回信确认合成信息;

        (3) 在得到客户认可后签订基因合成协议,要求客户支付合成总费用的50%作为预付款;

        (4) 本公司收到预付款后立即安排生产,进行引物合成、DNA片段拼接等工作,将全长基因克隆于载体中,通过DNA测序确认合成基因的正确性;对错误位点用定点突变方法进行修复,最后得到与客户提供序列完全一致的基因;

        (5) 基因合成结束,通知客户支付剩余的50%合成款项;

        (6) 待客户付余款之后及时给客户发货。

Q 4. 合成的基因有长度限制吗?

        可以合成任何长度的基因。

Q 5. 密码子优化有必要吗?

        有必要。不同来源的种属密码子的偏好性不同。比如,在人体内受偏爱的密码子对于E. coli来说可能是稀有的。百力格公司已经为国内外客户优化了大量的基因,有自主研发的专业软件。可免费为客户提供密码子优化服务。

Q 6. 百力格公司的标准免费克隆载体是什么?

        (1) pUC系列(pUC18/pUC19/pUC57),pBluescript II SK(+),PCR2.1等载体:含有若干常用限制性内切酶识别序列;

        (2) pTG19-T 载体:适用于T/A克隆;另外,本公司还有近300种商业表达载体(如pET系列,pPIC系列)可供基因合成后克隆选择;若有特殊要求,需换到一些特殊载体或改造过的载体,为方便后续实验的及时进行,请提供载体及相关的载体信息。

Q 7. 百力格公司的合成时间如何?

        1500bp以内的常规基因,承诺15个工作日内发货。

Q 8. 为什么基因合成的费用比引物合成高的多?

        基因合成包括一个完整的流程:序列分析、优化、引物设计与合成、引物拼接与PCR扩增,PCR产物的T/A克隆,测序筛选,点突变修复、发货准备等一整套服务,而引物合成只是基因合成工作中的一小部分。如同买一辆汽车与买一堆铁块和橡胶是一个道理。

Q 9. 基因合成必须要提供基因序列吗?

        是的。您必须提供AA序列或者DNA序列。我们只根据您提供的序列进行基因合成,可以提供免费密码子优化,但是不提供基因序列的查询服务。

Q 10. 必须要签定合同与交纳50%预付款吗?

        是的,为保障双方权利与信誉,应该这么做。

Q 11. 质量如何保证? 时间如何保证?

        所有在 百力格合成的基因,都经过100%测序验证。 百力格公司基因部拥有独立的分子生物学实验平台;本公司引物合成部、测序部,分子生物学试剂盒部,是基因合成部的根本保障。基因部主管拥有十年以上专业合成基因的工作经验,基因合成的工作团队均经过专业、严格的培训,能保证所承接项目顺利进行。

Q12.什么样的基因是复杂基因?

        低GC含量序列:低GC含量的基因序列一般是指全长GC含量低于20%的基因,或100bp以内GC含量少于10%的序列;对于低GC片段,不包含发卡结构、反义互补、重复等其它复杂结构,一般将其分割成200bp/段来合成,然后通过合适的内切限制酶酶切后连接(常用BsaI和BpiI,所以序列本身最好不含有这两种酶切识别序列),这样更易得到正确的克隆,但是发货期将比正常序列更长一些,而且价格也比常规基因稍贵。一般低GC序列都可以合成并可通过测序验证。

        高GC含量:高GC序列一般是指GC含量高于70%的序列或100bp以内GC含量高于80%的序列;与低GC序列不同,高GC序列难于测序,所以GC>75%的序列合成业务,请特别询价,对于此类序列也需要将其分割成300bp的片段来合成,需要合适的内切限制酶,如BsaI 和 BpiI。

        反义互补重复序列:由于此类结构序列也不易于测序,所以我们一般不承接反义互补重复序列合成业务。

        复杂基因与常规基因相比,合成费用较高,合成时间相对延长。对于复杂基因,可通过密码子优化,尽量减少基因序列中的重复序列,高GC%区和二级结构区。

Q 13.客户收到的基因为什么质粒切不动,或切不全?

        可能原因如下:

        (1)     质粒上酶识别序列不正确或者没有;

        (2)     酶切反应条件不合适

        (3)     限制性内切酶对DNA甲基化敏感;

        (4)     内切酶稀释不正确或加入方法不正确;

        (5)     甘油浓度过高;

        (6)     限制性内切酶已部分或全部失活;

        (7)     保护碱基引入导致侧翼链锁死酶切位点。

        对策:

        (1)     检查质粒DNA中是否存在可被限制酶识别的DNA序列。

        (2)     优化酶反应体系,使用随酶提供的反应缓冲液;增大酶量或更换新酶。

        (3)     检查DNA是否已被甲基化,所用的酶是否对甲基化敏感。

        (4)     更换保护碱基,或PCR扩增目的片段,酶切PCR产物。

Q 14. 如何运输以及保存质粒及其菌株?

        我们为您提供含有完全正确的基因序列的质粒(不少于5ug)两管。质粒可常温运输,溶解后需-20℃保存,并尽量避免反复冻融。

Q 15. 客户提供样品做相关服务时,送样要求有哪些?

        质粒样品,可以是穿刺菌、甘油菌、冻干质粒或质粒溶液等形式。

        (1)穿刺菌:请提供穿刺培养的单克隆菌落。穿刺培养的菌可以长时间保存而不会导致质粒的拷贝数明显下降。样品请在1.5ml或2ml的Eppendorf管中加入相应抗生素的固体LB培养基,然后将单菌落用牙签穿刺于LB固体培养基中。

        (2)菌液:请将过夜培养的菌液加灭菌甘油至终浓度20%保存于1.5ml或2ml的Eppendorf管中,注意封口,以免污染。

        (3)质粒:请提供3-5ug溶于无菌去离子水的质粒溶液或者抽干质粒。

        (4)注意:

           a. 请将装有样品的Eppendorf 管口用封口膜封紧,防止运输途中开盖导致样品污染或者丢失。

           b. 请在管壁上注明质粒名称及抗性。

           c. 载体其他信息请以邮件或便签等形式告知。

 

3 .定点突变

        通过实验方法可以有效地向目的基因片段中引入任何所需的 DNA 变异,包括碱基添加、删除、点突变等。

服务要求

        1. 请您通过业务员或技术员提供需要进行突变基因的全部详细序列;突变前序列请标注为: Wild sequence ;突变后序列请标注为: Mut sequence 。

        2. 请提供突变基因克隆操作的详细背景资料,例如使用何种限制酶酶切位点、克隆于何种载体等。

        3. 请说明实验的具体要求。

操作程序

        1. 如您提供的模板序列为非百力格生物的测序结果,我们将首先对模板进行测序并将与您沟通测序结果。

        2. 根据突变方案设计合成突变引物,进行基因突变实验的 PCR 反应,克隆变异体。

        3. 进行 DNA 测序验证突变序列的正确性。

        4. 提供实验结果,包括实验操作规程、突变用引物、质粒变异体以及含有该质粒的菌种(穿刺菌)、测序结 果、测序彩色峰图等。

        5. 1 kbp 以下的 DNA 片段克隆在普通载体上的单点突变的时间约需 10 天左右。

收费标准

变点 1个 2个 3个 3个以上
<1000bp ¥1500 ¥2500 ¥3500 询价
1000-2000bp ¥2000 ¥3500 ¥4500 询价
时间 20个工作日 25个工作日 30个工作日 协商

 

基因组 DNA 的提取

        可以从多种材料中提取基因组 DNA ,不同种类的材料中提取的 DNA 量不同,而且差异也比较大,现就一般材料的基因组 DNA 提取情况列表如下:

不同样品 样品要求 起始量 得率
血液 新鲜摆渡或抗凝血 100ul 0.1-0.3ug
动物细胞 细胞悬液或收集的细胞 1 × 10 6 10ug
动物组织 一般材料 100mg 100ug
植物 一般材料 100mg 10ug
细菌 OD 600 = 1.5 的大肠杆菌培养液 1ml 1-2ug

 

说明:

        1. 每种材料必须保证尽量新鲜。

        2. 实验完成后,提供 DNA 样品、电泳照片、 OD值测定结果等。

 

4 .百力格全基因合成服务特色

        合成任何基因

        Gene-Target TM技术平台可以合成任何基因,包括富含特殊结构如:重复序列(重复次数无限制)、高GC含量、发夹结构、连续单一碱基重复等的复杂基因。

         克隆基因到任何载体

        CloneEZ®无缝克隆技术可以将合成基因克隆至任何目的载体,交付后可直接用于后续操作实验。

        快速合成基因 

        百力格快速基因合成服务为您快速交货,合成2 kb以内的基因,最短仅需4个工作日。

        良好的客户信任度

       服务质量可靠,提供DNA测序结果,保证所合成的基因序列100%准确。百力格为客户合成的许多基因,在其发表的高水平文章中得到引用。

       保证客户信息安全 

       特有的安全制度保证客户的信息安全,公司严格按照与用户签定的基因合成服务协议和保密合同执行服务。

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